Prosedur Pembuatan Sediaan Histologis (Processing Of Tissue)

Dehydrating, Clearing, and Infiltering

Setelah blok spesimen jaringan (testis) diambil dari hewan eksperimen disayat setebal tidak melebihi 0,5 cm, kemudian difiksasi dalam larutan formalin buffer (buffered neutral formalin) 10 % selama 24 jam. Lama fiksasi tergantung kepada ketebalan blok jaringan. Selanjutnya blok jaringan dilakukan penarikan air (dehydrating) dengan cara direndam dengan alcohol bertingkat mulai dari alcohol 80% - 95% - 95% - 100% - 100% - 100% masing-masing selama 2 jam, kemudian dilakukan penjernihan (clearing) terhadap alcohol dengan merendam didalam larutan silol / benzol / kloroform 2 kali perendaman (silol 1 – silol 2) masing-masing selama 1,5 jam. Kemudian dilakukan pemasukan (infiltrasi) parafin kedalam blok jaringan dengan merendamnya didalam parfin cair 3 kali (parafin 1 – 2 – 3) masing-masing selama 2 jam. Setelah proses infiltrasi selesai dilanjutkan dengan penanaman (embedding) didalam cetakan parafin blok untuk dilakukan pemotongan. Proses pemotongan (sectioning) blok jaringan dengan menggunakan pisau mirkotom setebal 5 – 6 µ dan dilekatkan pada kaca objek (object glass) yang sudah diolesin dengan albumin telur sebagai perekat.

Routine Staining (H&E)

Pewarnaan dengan menggunakan haematoksilin (Harris’s hematoxylin) dan eosin yang bersifat larut dalam air (aqueous solution), maka sayatan (slides) direndam didalam air (rehidrasi) dan kemudian dihilangkan parafin dengan merendamnya didalam silol 2 kali masing-masing selama 2 kali, alkohol/etanol absolute (100%) 2 kali masing-masing selama 1 menit, alkohol 95% masing-masing selama 1menit, larutan iodin selama 10 menit, celupkan 4 kali dalam air mengalir, rendam kedalam larutan hematosilin harris selama 15 menit, celupkan 4 kali dalam air mengalir, celupkan 3 – 10 kali dalam asam alkohol, air menghalir, rendam kedalam larutan eosin selama 2 menit, rendam dalam alkohol 95% 2 kali masing-masing selama 1 menit, alkohol 100% 2 kali masing-masing selama 1 menit dan rendam didalam silol 3 kali masing-masing selama 2 menit dan olesin (mounting) dengan balsam kanada / entelan dan terakhir ditutup dengan kaca penutup (cover sleep) selanjutnya mati di bawah mickroskop cahaya (light microscope) diawali dengan pembesaran kecil 10 x 10 dan dilanjutkan dengan pembesaran 10 x 40.

Secara singkat tahap pewarnaan : deparafinisasi dalam silol --- alkohol bertingkat mulai dari absolut (tinggi ke rendah) --- air ---zat warna (H&E) --- air --- alokohol bertingakat mulai dari alkohol absolut (rendah ke tinggi) --- silol --- mounting (mounting medium yang larut dalam silol dan tutup dengan cover glass).